洞窟魚の赤血球の変化は、減少した地下酸素への適応の証拠を提供する

Scientific Reports volume 12、記事番号: 3735 (2022) この記事を引用

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極限環境に生息する動物は、さまざまな圧力に応じた適応進化を調べる強力な機会を与えてくれます。 そのような圧力の 1 つは還元酸素であり、通常、高地や地下環境に存在します。 洞窟に住む動物は暗闇と飢餓にも対処しなければなりません。どちらも洞窟に関連する形質の進化を促す重要な要因として厳密に研究されています。 興味深いことに、環境圧力としての低酸素症はあまり注目されていません。 今回我々は、淡水硬骨魚 Astyanax mexicanus で進化していると推定される適応表現型を調べました。これには、地表と洞窟に生息する形態の両方が含まれます。 このモデル システムは、密接に関連した表面同種と並んで、多数の自然の独立して定着した洞窟個体群の存在により、低酸素に対する収束反応を特定する機会も提供します。 この研究の焦点は、酸素の輸送と供給に不可欠な分子であるヘモグロビンです。 私たちは、複数の洞窟個体群の血液中に高濃度のヘモグロビンが存在することを発見しました。これは、表層魚と比較して洞窟形態の赤血球サイズの増加と一致しています。 興味深いことに、洞窟形態と表面形態の両方で、血液単位あたりの赤血球数が同程度であり、ヘモグロビンの上昇が赤血球の過剰産生によるものではないことを示唆しています。 あるいは、洞窟魚の赤血球の細胞面積が増加しているため、洞窟魚には赤血球あたりより多くのヘモグロビンが含まれていると考えられます。 これらの発見は、洞窟魚がヘモグロビン生成と赤血球サイズの両方の調節を通じて洞窟内の低酸素状態に適応してきたという考えを裏付けるものである。 この研究は、アスティアナックス洞窟魚のさらなる適応的特徴を明らかにし、強い環境圧力下で進化する生物には細胞構造と分子変化の間の調整された変化が必要であることを実証する。

極限の環境条件とこれらの圧力に対する生物の反応との間の複雑な相互作用についての私たちの理解は依然として不完全です。 極限環境での適応を研究するための強力な自然モデルは、目の見えないメキシコの洞窟魚 Astyanax mexicanus です (図 1a)。 この種は、川に生息する「地表」形態と偏性地下「洞窟」形態の 2 つの現存形態型の直接比較を可能にします。 現存する 30 の洞窟個体群 1 は、メキシコ北東部のシエラ デ エル アブラ地域の露出した石灰岩カルスト内の地下洞窟のネットワーク全体に分布しています (図 1a)。 この表面から洞窟への移行には、推定約 2 万年から 50 万年にわたって、目の喪失、色素沈着、非視覚感覚の増強などの表現型の変化が伴いました 2,3。 発見以来 80 年間で 4、退行特徴の根底にあるメカニズムの理解に向けてかなりの進歩が見られましたが、エル・アブラ カルスト系の環境圧力は主に限られた光と栄養の影響を調べたものでした 5。

Astyanax mexicanus 洞窟魚の複数の個体群は、表層の魚と比較してヘモグロビン濃度が高くなります。 Astyanax mexicanus は洞窟形態型と表面形態型で構成されます。 洞窟形態はメキシコ北東部のエル・アブラ山脈の多数の洞窟に分布していますが、表面形態は近くの川、小川、湖に生息しています(a)。 3 つの洞窟魚の個体群はそれぞれ、同種の表面形態よりも統計的に有意に高いヘモグロビン濃度を示しました (b、Chica WRS p = 0.005、Tinaja WRS p = 0.0005、Pachón WRS p = 0.0001)。 ヘモグロビン濃度は分光光度分析によって測定されました (c)。 異常値は検出されませんでした。

地下洞窟に一般的に存在する環境圧力の 1 つである酸素レベルの低下は、あまり注目されていません。 世界中の地下環境では、生物の呼吸 6、光合成入力の欠如 6、および地表大気との空気の混合の制限 7 により、周囲の地上環境と比較して酸素レベルが低下していることがよくあります。 エル・アブラの 2 つの洞窟、パチョンとティナハで溶存酸素の実験的測定が行われ、周囲の地表水と比較して洞窟プールの酸素レベルが著しく低いことが実証されました (DO = 2.97 mg/L に対し、パチョン洞窟では 8.20 mg/L)。表層環境 (ラスコン); 表層環境 (ナシミエント デル リオ チョイ) の飽和率 80% と比較して、ティナハ洞窟の飽和率 59% 8,9. この環境特徴はアスティアナックス洞窟魚の進化に影響を与えた可能性が最も高いですが、これを明らかにした研究はほとんどありません。は、この圧力を軽減する推定上の適応機能に取り組みました10、11、12。

気候変動の世界的な影響 13、14、15 と、その結果として生じる自然の溶存酸素レベルへの影響のため、いくつかの硬骨魚種で低酸素耐性が研究されています。 低酸素に対する複雑な反応には、行動の変化（ボラの捕食者回避の減少16）、形態学的変化（フナの鰓のリモデリング17）、および分子の変化（ゼブラフィッシュの酸素感知遺伝子HIF-1の発現の増加18）が含まれます。

脊椎動物は末梢組織に十分な酸素を届けるために、ヘモグロビンタンパク質を酸素運搬体として利用します。 ヘモグロビン分子には 4 つの四量体が含まれており、それぞれが 1 つの酸素分子に結合し、ヘモグロビンタンパク質ごとに 4 つの酸素分子を負荷します。 自然の酸素濃度は環境によって大幅に変化する可能性があり、多くの動物は標準代謝率を維持するために正確な酸素レベルを必要とします。 したがって、ヘモグロビンの遺伝子とタンパク質は、脊椎動物分類群全体で進化的な変化を受けてきた可能性があります19。 これらには、ヘモグロビン遺伝子のゲノム構成の数値的変動 20、タンバキにおけるヘモグロビン濃度の増加 21、またはレッドドラムにおけるヘモグロビン結合親和性の増加 22 が含まれます。 ここでは、ヘモグロビン濃度が酸素送達の主要な分子輸送であるため、ヘモグロビン濃度を調べました 23。

私たちは、ヘモグロビン濃度と赤血球のサイズに影響を与える洞窟魚の変化を特定しました。これは、低酸素の洞窟環境に適応している可能性があります。 これらの変化は、近縁の表面形態には見られないが、アスティアナックス洞窟魚が何世代にもわたって同じ飼育条件下で飼育された（そして持続していた）ことを考えると、おそらく低酸素耐性を与えていると考えられる。 したがって、このモデルは、野生におけるヘモグロビン輸送と低酸素耐性の変化の遺伝的基盤を特定するユニークな機会を提供します。

ヘモグロビンは、ほぼすべての脊椎動物における主要な酸素輸送分子です19。 私たちは最初に、アスティアナックス洞窟魚が発見されているエル・アブラ洞窟からの直接測定に基づいて、（地上環境6と比較して）洞窟環境における酸素の減少への適応として、洞窟形態のヘモグロビンレベルが高い可能性があると推論しました8,9。 低酸素に対する適応メカニズムの 1 つは、全身輸送に利用できる酸素を増やすためにヘモグロビン濃度を増加させることです 24,25。

分光光度法によるアプローチ (「材料と方法」) を使用して、表層魚 (n = 26) の平均ヘモグロビン濃度が 8.25 ± 0.23 g/dL であることがわかりました (図 1b)。 調査した 3 つの洞窟魚個体群 (チカ、ティナハ、およびパチョン洞窟魚) はすべて、表層魚よりも有意に高い平均ヘモグロビン濃度を示しました (チカ n = 8、平均 = 9.86 ± 0.43 g/dL、ウィルコクソン順位合計 (WRS) p = 0.005; ティナハ n = 8、平均 = 10.60 ± 0.38 g/dL、WRS p = 0.0005; Pachón n = 30、平均 = 10.49 ± 0.39 g/dL、WRS p = 0.0001; 図 1b）、しかし互いに違いはありませんでした（図 1b）。 .1b)。 おそらく、より高いヘモグロビン濃度により、洞窟モルフは洞窟内の限られた溶存酸素に対処できるようになります。 しかし、多様な細胞の特徴がヘモグロビン濃度の増加に寄与している可能性があるため、次に赤血球 (つまり、赤血球) の細胞の特徴を調べました。

ヘマトクリットは、所定の血液量のうち赤血球が占める部分です（図 2a）。 ヒトにおける特定の臨床表現型、例えば真性赤血球増加症 26 は、ヘマトクリット値の上昇に基づいて診断されます 27,28。 したがって、洞窟魚のヘモグロビン濃度が高いのは、表層魚と比較してより多くの赤血球が存在するためである可能性があります。 ヘモグロビンの上昇が赤血球の過剰産生によって媒介されているかどうかを判断するために、表面形態と洞窟形態の間のヘマトクリットを比較しました。

ヘマトクリットは、表層の魚よりも洞窟魚の方が高い傾向があります。 総血液量に対する赤血球の割合（ヘマトクリット）は、微小毛細管の遠心分離によって測定されました。 赤血球相は毛細管の遠位端に集まりますが、バフィーコートと血漿はより近位に集まります (a)。 個体群を個別に比較した場合には統計的有意性は得られませんでしたが（地表と比較; Chica WRS p = 0.115、Tinaja WRS p = 0.018、Pachón WRS p = 0.161）、各洞窟魚個体群では地表と比較してヘマトクリットが高い傾向が明らかでした。 (b)。 しかし、形態型（すべての洞窟魚に対する表面）で比較すると、洞窟魚は統計的に有意に高い平均ヘマトクリットを持っています（表面 n = 8、平均 = 28.51 ± 0.03%、洞窟 n = 24、平均 = 36.14 ± 0.01%、WRS p = 0.024）表層の魚よりも。 統計的有意性は変化しませんでしたが、1 つの外れ値 (最も低い Chica 値) が検出されました (表 S6)。

ヘマトクリット測定値は、表層の魚と比較して、調査したすべての洞窟個体群でより高い傾向がありました（図2b）。 まず、表層形態と洞窟魚の形態（個々の洞窟魚の産地に関係なく）の比較（ウィルコクソン順位和検定）を実行しました。これにより、これらのグループ間の有意な違いが明らかになりました（表層 n = 8、平均 = 28.51 ± 0.03%、洞窟 n = 24、平均） = 36.14 ± 0.01%、WRS p = 0.024)。 次に、4 つの母集団のそれぞれを相互に比較する事後分析を実行しました。 これらの結果は、同じ傾向を明らかに示しましたが、ボンフェローニ補正後の統計的有意性は達成されませんでした (表面との比較; Chica WRS p = 0.115、Tinaja WRS p = 0.018、Pachón WRS p = 0.161、Bonferroni 補正により、p 値は統計的有意性を達成するには < 0.0083)。 しかし、洞窟魚のヘモグロビン濃度が高いことを考えると、洞窟魚のヘマトクリットが一様に上昇していることは驚くべきことではありません。 ヘモグロビン測定と一致して、ティナハ洞窟の個体群が最も高いヘマトクリット値を示し（平均ヘマトクリット = 39.23 ± 0.03%、図 2b）、次にパチョン洞窟（平均ヘマトクリット = 35.56 ± 0.03%、図 2b）が続きました。洞窟個体群は、洞窟個体群の中で最も低いヘマトクリット（平均ヘマトクリット = 33.63 ± 0.01%、図 2b）を示しています。 これらの結果を考慮して、次に各集団の赤血球の数値変動を調べました。

我々は、洞窟魚の個体群は、より高いヘモグロビン濃度とヘマトクリット値を反映して、表層魚よりも高い赤血球密度を持っている可能性があると予想しました。 予想外なことに、表層魚の赤血球密度が最も高かった（n = 8、平均密度 = 2.1 × 106 ± 1.4 × 105/mm3、図 3c-c'）。次にパチョン洞窟魚（n = 8、平均密度 = 2.0 × 106 ± 8.2 × 105/mm3、図 3f-f')。 興味深いことに、ティナジャとチカの洞窟魚は平均密度がわずかに低かった（それぞれn = 8、1.6×106±1.8×105/mm3およびn = 8、1.5×106±6.7×104/mm3、図3d〜e'）。 チカはパチョンとは統計的に異なりましたが（WRS p = 0.001、図3b）、これらの個体は成体として商業的に入手されたものであるため（「材料と方法」）、そのため正確な年齢は不明です。 全体として、赤血球密度は表面と洞窟の形態全体で同等でしたが、洞窟集団のヘモグロビン濃度とヘマトクリット値がより高かったことを考慮すると、これは予想されませんでした。 洞窟魚では一般に赤血球密度が低下しているため、赤血球細胞サイズの違いが洞窟魚のヘモグロビン濃度の高さを説明できるかどうかを検討しました。

赤血球密度は、Astyanax の形態型全体で同等です。 血球計を使用して、標準血液量中の赤血球の密度を測定しました (a)。 Chica 集団では統計的な差異が検出されましたが (p < 0.0023)、平均赤血球密度は形態型間で同等でした (b)。 赤血球はアクリジンオレンジで染色され、光学顕微鏡で視覚化され（c〜f）、ImageJ29（v2.0.0）を使用して計数されました（c '〜f'、スケールバー130μm）。 2 つの外れ値が検出されました (サーフェスでの最低値とチカでの最高値)。 これらの異常値を除去すると、Chica と Surface の間に統計的に有意な差が生じました (表 S6)。

標準血液量における赤血球の二次元面積を測定し、赤血球のサイズが洞窟と表面の集団間で異なるかどうかを判断しました。 血液塗抹標本を収集し、染色し、光学顕微鏡を使用して分析しました。 赤血球は明確に同定され (「材料と方法」)、手動でピクセル単位でスコア付けされ (ImageJ29 v2.0.0)、直接比較するために µm に変換されました。 洞窟魚はヘマトクリットとヘモグロビンが高いものの、赤血球密度は同等であるため、各洞窟個体群はより大きな赤血球面積を示す可能性があると予想されました。 実際、表層魚の赤血球はすべての個体群で最小でした（n = 8、平均面積 = 71.36 ± 1.43 μm2、図4a）が、ティナジャ個体群の赤血球は平均して洞窟個体群の中で最大でした（n = 8、平均面積）。面積 = 86.05 ± 0.96 μm2、図 4c)、次いでチカ (平均面積 = 85.70 ± 1.38 μm2、図 4b)、パチョン洞窟魚 (平均面積 = 84.06 ± 1.52 μm2、図 4d)。 3つの洞窟個体群すべての赤血球は、表層の魚よりも有意に大きかった（チカWRS p = 0.0002、ティナジャWRS p = 0.0002、パチョンWRS p = 0.0006、図4e）。 この細胞サイズの増加は核面積の増加を伴わなかった。 表層魚を含む各集団について、核の二次元面積は0.5μm2（14.9±0.24μm2、図4f）を超える違いはなく、赤血球面積の違いがヘモグロビンが見られる細胞質の増加に起因することを示唆しています。

洞窟赤血球の二次元表面積は、表面赤血球よりも著しく大きい。 各集団の赤血球をライトギムザで染色し、光学顕微鏡で視覚化しました（a〜d、スケールバー10μm）。 ImageJ29 (v2.0.0) では、各赤血球の合計 (a ～ d、黄色のリング) および核 (a ～ d、濃い青色のリング) の 2 次元領域が計算されました。 総表面積は、表面と比較してすべての洞窟個体群で有意に高かったが（p < 0.00003）、相互に違いはありませんでした（e）。 二次元総面積は洞窟魚の方が大きかったが、核の二次元面積には差がなかった(f)。これは、二次元総面積の違いがヘモグロビンが存在する細胞質の違いによるものであることを示唆している。 。 2 つの外れ値が検出されました (最高の Chica 値と最低の Pachón 値)。 これらの外れ値を除去しても統計的有意性は変わりませんでした (表 S6)。

集団間のヘマトクリットの差が赤血球数の増加によって支配されない場合、ヘマトクリットの変動は赤血球サイズの違いと相関している可能性があると推論しました。 定性的比較はこの傾向を示していると思われたので、これを定量的にテストするために、平均ヘマトクリット値に対する平均赤血球サイズと平均赤血球密度の両方の相関関係を実行しました。 赤血球密度の測定値は、ヘマトクリットとの相関が低いことを示しました（r = - 0.433、図5a）。 対照的に、赤血球面積はヘマトクリットと強い正の相関関係を示し（r = 0.869、図5b）、Astyanax 洞窟魚の個体群全体でのヘマトクリットの上昇の変動が赤血球サイズの関数であることを示唆しています。

赤血球のサイズは、Astyanax の洞窟や表層の魚のヘマトクリット値と正の相関があります。 どの赤血球の特徴 (密度またはサイズ) がヘマトクリットと相関しているかを決定するために、ピアソンの相関関係を実行しました。 平均赤血球密度はヘマトクリットと相関しませんでした (r = − 0.4329、a)。 しかし、赤血球集団の二次元表面積は、ヘマトクリット値と強い正の相関関係を示しました (r = 0.8688、b)。

我々は、ヘモグロビン濃度と赤血球密度を統合して単一の赤血球内のヘモグロビンの質量を推定する指標である平均赤血球ヘモグロビン（MCH、「材料と方法」）を計算することによってこれをさらに評価しました。 他の調査結果と一致して、地表の個体群は平均 MCH 値が最も低く (平均 MCH = 39.41 pg、表 1)、チカの個体群は 3 つの洞窟個体群の中で最も高く、ティナハ、パチョンがそれに続きました (平均 MCH = 66.01 pg、表 1)。それぞれ 65.02 pg、および 52.20 pg; 表 1)。 したがって、赤血球サイズの増加（ヘマトクリットの上昇に関連している）は、天然の洞窟魚の個体群におけるヘモグロビンレベルの増加に寄与している可能性があります。

ヒトでは、赤血球のサイズはヒト集団全体で安定しているため、ヘマトクリット スコアは、所定の血液量に対する赤血球の寄与率の相対的な尺度を提供します 30。 洞窟魚は表層の魚と比較してヘモグロビンのレベルが高くなります。 洞窟魚ではヘマトクリットレベルが上昇していますが、これはおそらく、より大きな（より多くの）赤血球の機能であると考えられます。

今回我々は、Astyanax の洞窟形態（チカ、パチョン、ティナハの 3 つの異なる洞窟産地由来）が、近縁の表層魚と比較して血中ヘモグロビン濃度がより高濃度になるように収束進化したことを報告する。 このヘモグロビンの増加により、洞窟魚は単位時間あたりより多くの酸素を全身組織に届けることができる可能性があります。 これにより、酸素が減少している期間でも好気呼吸を維持して、持続的な採餌活動をサポートできる可能性があります31、32、33、34。 ヘモグロビンの増加と一致して、洞窟形態のヘマトクリット スコアは高くなります。 これは通常、赤血球密度が高いことを示していますが 27,28、洞窟魚は表層魚と比較して赤血球が多いわけではありません。 むしろ、赤血球のサイズは洞窟と地表の個体群によって異なり、洞窟魚は均一に増加した赤血球サイズを保有しており、これがヘモグロビンのレベルが高いことの一部を説明しています。

永遠の暗闇や限られた栄養など、洞窟魚が直面する困難な環境圧力の中には、上層の表層水に比べて酸素が少ないことが含まれます6。 限られた酸素は、他の硬骨魚種の行動、生理機能、および特定の形態に影響を与えることが示されています16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、35。 私たちのシステムでの今後の研究は、酸素が豊富な環境に生息する同種の「代理祖先」形態と、低酸素水域で数万年から数十万年にわたって繁栄してきた派生した洞窟形態との間でこれらの特徴を直接比較する機会を提供します2。 3.

Astyanax 集団間の赤血球サイズの不一致は、洞窟形態におけるヘマトクリットとヘモグロビン濃度の増加についての少なくとも 1 つの説明を提供します。 興味深いことに、赤血球のサイズは硬骨魚類の種によって大きく異なります。 Snyder と Sheafor36 は、赤血球サイズの変化が効率的な酸素拡散を維持するが、それは毛細管の直径の変化に応じて変化することを示唆しました。 細胞と毛細血管のサイズはどちらも分類群によって異なりますが、この 2 つの関係は一定のままです。 平均して、赤血球の幅は毛細血管の直径より 25% 大きくなります 36。 興味深いことに、彼らは赤血球のサイズと酸素運搬能力（ヘモグロビン濃度を含む）との間に相関関係を見つけられず、効率的な流れと拡散を維持するために赤血球のサイズが変化すると結論づけました。

Lay と Baldwin 37 は、核サイズと酸素供給のどちらが硬骨魚類 52 種の赤血球サイズの変動をより適切に説明できるかを調査し、赤血球サイズとヘモグロビン濃度の間に逆相関があることを発見しました。 興味深いことに、彼らは赤血球のサイズと好気性遊泳能力との間に逆相関があることも報告しました28,38。 具体的には、短時間の素早い動きで泳ぐ魚は赤血球が小さい傾向があり、好気性の水泳の増加は赤血球の数の増加と関連していました39。

この関係の 1 つの説明は、赤血球の体積に対する表面積の比が大きいと酸素の拡散距離が短くなり、必要なときに酸素をより速く取り込むことができるためである可能性があります 37。 体積は表面積よりも速く増加し、洞窟魚の赤血球は表層の魚の赤血球よりも大きいため、洞窟魚の赤血球は表面積と体積の比が低いと考えられます。 洞窟モーフの活動は、表層の魚と比較して平均速度が高いという特徴があります 34 が、表層の魚は素早く、短い「バースト」運動を利用します 40。 洞窟魚は赤血球の数は少ないものの、より大きな赤血球を持っているため、これは自然の活動レベルの違いを反映している可能性があります。 同様の結果が、形態型間の心臓のサイズと形状の違いに関連して、Tang et al.12 によって議論されました。 洞窟魚は、表層の魚よりも小さく、三角形ではありませんが、そのため「スポンジ状」の心臓を持っています。 海綿状の心臓は、小柱に対する緻密な壁組織の比率が小さく、これは座りがちな活動プロファイルに関連しています41。 さらに、小柱が多い心臓は循環血液にさらされる表面積が大きくなり、ガス交換が増加するため、低酸素環境における洞窟魚にとって有利になる可能性があります12。

今回我々は、低酸素の洞窟内でアスティアナックス洞窟魚に適応上の利点をもたらすと考えられるいくつかの血液表現型を測定した。 しかし、この種の低酸素耐性を可能にする根本的なメカニズムを含め、多くのことはまだ不明です。 低酸素飼育下での全体的な遺伝子発現変化を特徴付けるために計画された今後の研究 42,43,44 により、低酸素耐性に影響を与える主要な差次的に発現される遺伝子が明らかになる可能性があります。 例えば、ビクトリア湖に生息するシクリッドの特定の集団は、祖先集団による低酸素への曝露の変動に基づいて、ヘモグロビンの発現の差異を示しています。 さらに、ヘモグロビン遺伝子のコード配列の変化は、コードされたタンパク質の機能に影響を与え、進化の過程で変化する周囲酸素レベルにおける酸素結合能力を改善する可能性があります20。

かなりの量の研究により、硬骨魚の低酸素に対する数十の適応反応が特定されています47。 Astyanax のその他の適応には、鰓の解剖学的構造と機能の変更が含まれる場合があります。 例えば、Moran et al.11 は、パション洞窟魚のえらは表層魚と比較して重く、パション／表層 F2 雑種の平均鰓質量は親の表層個体群よりも大きいと指摘しました。 これは、洞窟内の低酸素の結果として正の選択が起こっていることを示している可能性があります11。 フナは、酸素交換を改善し、エネルギー的に高価な不必要なイオン交換を制限するためにえらを「改造」することができます17,48。 おそらく、鰓の形態に対する同様の変化により、低酸素の洞窟内でより効率的な酸素の摂取とエネルギーの節約がもたらされる可能性があります。

最後に、退行的特徴（失明など）の進化に加えて、側線の拡張 49,50 や味覚系 51,52 など、多くの建設的な非視覚感覚形質が洞窟魚では進化しました。 Astyanax における未調査の感覚モダリティの 1 つは酸素感知です。 神経上皮細胞（NEC）は魚類の主要な酸素感知細胞であり、鰓フィラメントおよびラメラ内の薄い上皮層全体に分布し、鰓の遠心面を覆っています53。 これらの細胞の位置により、酸素分圧の外部 (周囲水) と内部 (細動脈) の両方の変化を感知する役割を果たしている可能性があります 53。 さらに、これらの細胞は、哺乳類の頸動脈体に存在する I 型化学受容体と相同です 54。 NEC のイオンチャネル発現の主な違いは、酸素欠乏抵抗性金魚の酸素耐性に寄与します 55。 極限の洞窟環境での生活の結果として他の感覚系が強化されたことを考えると、酸素の感知における同様の変化が、酸素の減少状況に対処するために同様に進化した可能性があります。

この研究で使用されたすべての動物は、シンシナティ大学の衛星水生施設で飼育され、複数のフィルター（カーボン、ミクロン、UV、高密度粒子）を備えた特注の逆浸透飼育ユニット内の 5 ガロンまたは 10 ガロンのタンクに収容されました。フィルター；カリフォルニア州サンディエゴのアクアニアリング）。 このシステムは、リアルタイム線量モニタリングを使用して、水を温度 24 ° (± 2 °C)、pH 7.4 (± 0.2)、導電率 750 μS/cm (± 50 μS/cm) に調整します。 Astyanax 洞窟個体群 (Pachón、Tinaja、Chica) と地表モルフの両方を 12 時間:12 時間の明暗サイクルで飼育し、乾燥フレーク フード (TetraMin Pro) とシステム水の混合物を 1 日 1 回 (午前 9 時まで) 与えました。 。 この研究で使用された表層魚、ティナハおよびパチョン洞窟魚は、もともとリチャード・ボロウスキー博士によって提供された繁殖成体 Astyanax mexicanus 標本に由来しました。 チカ洞窟魚は商業的に入手されたものであるため、これらの個体の正確な年齢は不明です。 ヘマトクリットを含む特定の血液パラメーターは人間の年齢とともに変化する可能性があるため、この研究では標準体長 40 mm 未満の魚を除外することで生物学的変動を最小限に抑えました。 標準長さの測定値はすべての個体について記録されたわけではありませんが、すべての個体が標準長さ 40 mm を超えていました。

氷冷システム水を使用して動物を麻酔し、31G シリンジ (BD Ultra-Fine™、BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ) を使用して尾静脈から血液を採取しました。 すべての個体群で同等の年齢と標準体長の魚を使用したところ、この研究ではどちらの要因も表現型スコアに有意な影響を及ぼさないことがわかりました（補足表S1〜S4）。 潜在的な死の影響を最小限に抑えるために、収集は午後 12 時から午後 5 時までに行われました。 すべての飼育条件および収集方法は、シンシナティ大学施設内動物管理使用委員会 (IACUC プロトコール # 10-01-21-01) によって承認されました。

ヘモグロビン濃度は、Aimstrip ヘモグロビン メーター (Germaine Laboratories、サンアントニオ、テキサス州、米国) で測定しました。 メーターは、メーカーの指示に従って使用前に校正され、光学的に検証されました。 10 μL の全血をテストストリップ上に置き (図 1c)、ヘモグロビン メーターに挿入しました。 濃度は分光光度法により自動的に計算され、g/dL で表示されました。

ヘマトクリット値は、12 箇所のマイクロヘマトクリット ローターを装備した LW Scientific ZipCombo 遠心分離機 (LW Scientific、ジョージア州ローレンスビル) を使用した遠心分離によって測定しました。 全血を毛細管に集め、反対側の端を粘土で密閉しました。 メーカーの推奨に従い、各毛細管を 12,000 rpm で 3 分間回転させました。 血液成分はいくつかの相に分離されました。はるかに多数で大きな赤血球が下相に集まり、バフィーコート（主に白血球と血小板）と血漿層が赤血球の上に集まります（図2a）。 赤血球相の長さと総血液量の長さを測定した。 ヘマトクリット率は、赤血球相の長さを総血液量で割ることによって決定されました。

各集団の赤血球の密度を決定するために、改良型ノイバウアー血球計（Hausser Scientific、ペンシルベニア州ホーシャム）を使用しました（図3a）。 1 µL の全血を、500 µL リン酸緩衝生理食塩水 (1x) の染色溶液と核染色アクリジン オレンジ (A1301、Invitrogen by Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) の作業溶液 20 µL で希釈しました。 この希釈液を室温で 20 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、10 μL を血球計上に置き、Leica DM2000 LED 複合顕微鏡 (Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ) を使用して視覚化しました。 画像は、顕微鏡に取り付けられた Leica DMC4500 カメラと Leica Application Suite (LAS) X ソフトウェア (バージョン 3.0.1.15878) で取得されました。

血球計数器には複雑なグリッド エッチングが装備されており (図 3a)、正確な領域内の細胞数を正確に計数する方法が可能です。 当社の複合スコープを使用した場合の最大の可視正方形領域は、0.75 mm × 0.75 mm、つまり 0.5625 mm2 でした。 3 つの異なる 0.5625 mm2 領域がカウントされ、各個人について平均されました。

総体積を推定するために、プラットフォームの両側の肩がプラットフォームの正確に 0.1 mm 上のカバー スリップを支えるように血球計数器を設計しました。 したがって、このセクションの総体積は 0.05625 mm3 になります。 細胞計数は、最初に「Color Threshold」ツールを使用して、ImageJ29 (v2.0.0) を使用して実行されました。 光学アーチファクトを除去するために、画像ごとにしきい値を手動で調整しました。 次に正方形の領域を選択し、「粒子の分析」ツールを使用してカウントを完了しました。 このツールを使用すると、サイズの除外が可能になり、アーティファクトがカウントされないようになります。 赤血球は白血球よりもはるかに大きいため、30 µm2 未満のフィーチャは除外しました。 生の細胞数を体積 (0.05625 mm3) で割り、希釈係数 (520) を掛けることで、1 mm3 あたりの細胞数 (つまり細胞密度) を計算しました。

7.5 μL の全血を顕微鏡スライドに塗布し、塗抹し、風乾し、メーカーの指示に従ってライトギムザ修正染色を使用して染色しました (WG16、Millipore Sigma、バーリントン、マサチューセッツ州、米国)。 9 個の細胞がランダムに選択され、手動で測定され、各個体の平均がとられました。 選択された各セルの向きはスライドに平行であり (最大長での短セルと長セルの直径)、他のセルに触れず、明らかな変形はありませんでした。 ImageJ29 の「ポリゴン選択」ツールと「測定」ツールを使用して、すべてのセルを画像化し、測定しました。 顕微鏡検査中に画像スケール バー (LAS X) と ImageJ29 の「直線」および「スケールの設定」ツールを使用して、各画像のピクセルをμm に変換しました。 各赤血球の核面積は、上で説明したように、総二次元面積を測定するために使用されたものと同じプロトコルを使用して測定されました。

すべての統計分析は、基本の 'stats'56 および 'Rmisc'57 パッケージを使用して R56 (バージョン 3.6.1) で完了しました。 これは最小の実験室集団からの適格な個人の最大数であるため、各集団から少なくとも 8 人の個人を各アッセイに使用しました。 盲検化は、1 人の研究者がデータを収集し (細胞の画像化)、識別キーを作成し、2 人目の研究者がデータを定量化して研究者に返す前に個々の命名法を削除することによって可能な場合に組み込まれました。 ウィルコクソン順位和 (WRS) テストを使用して、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、赤血球密度、赤血球サイズの統計的有意性を検出しました。 これらのアッセイのすべての p 値は、多重比較のためにボンフェローニ補正されました。 p < 0.0083 の場合、統計的有意性が達成されました。 ピアソンの相関関係は、基本の 'stats'56 パッケージを使用して R56 で計算されました。 Shapiro-Wilk 正規性検定を使用して、各アッセイで各母集団の正規性を検定しました。 パチョンの 2 次元核面積測定値を除いて、すべての集団は正規分布に従いました (表 S5)。 外れ値の存在をテストするために追加の分析が行われました。 我々は、Hampel フィルターを使用して各アッセイですべての集団をテストしました58。 このテストでは外れ値が検出されましたが、外れ値の除去は単一の統計的有意性のみに影響を与えました (図 3b、表 S6)。 収集されたすべてのデータ (外れ値を含む) がこの原稿に示されています。 雄魚と雌魚の両方がすべてのアッセイに含まれました。 ウィルコクソン順位和検定分析（ヘモグロビン濃度については n = 42、ヘマトクリット、赤血球密度、および 2D 面積測定については n = 32、各形態を含む）に基づいて、私たちが調べた血液パラメータにおいて性別は生物学的要因ではないようです。各アッセイについて (補足表 S1 ～ S4)。 平均赤血球ヘモグロビン (MCH) は、赤血球あたりのヘモグロビンタンパク質の質量を推定します。 この値は、1 リットルあたりのヘモグロビンのグラム数を 1 ミリリットルあたりの赤血球数 (百万単位) で割ることによって計算され、赤血球あたりのヘモグロビンのピコグラムが得られます59。 散布図は、「ggpubr」60 パッケージを使用して R56 で作成されました。 箱ひげ図は、'ggplot2'61 パッケージを使用して R56 で作成されました。 これらのプロットでは、ひげは 1.5xIQR を超えない最小値または最大値まで伸び、水平線は第 1 四分位数と第 3 四分位数、および中央値を表します。 すべての画像は Microsoft PowerPoint (バージョン 16.23) で編集されました。

シンシナティ大学施設動物管理使用委員会 (IACUC プロトコル # 10-01-21-01) は、この研究で Astyanax mexicanus を使用するためのすべての飼育条件と収集方法を承認しました。 さらに、この研究はバーゼル宣言と ARRIVE ガイドラインに概説されている原則に準拠しました。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、補足情報で入手できます。

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著者らは、このプロジェクトに関する有益な議論と養殖の支援をしてくれた現および元のグロス研究室のメンバー、特にダニエル・バーニングとアリッサ・ハムに感謝したいと思います。

シンシナティ大学生物科学部、シンシナティ、オハイオ州、45221、米国

タイラー・E・ボッグス、ジェシカ・S・フリードマン、ジョシュア・B・グロス

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TEB と JBG が実験を設計し、TEB と JSF が実験を実行し、TEB と JBG がデータを分析し、TEB と JBG が本文を執筆しました。 著者全員が最終原稿をレビューしました。

ジョシュア・B・グロス氏への往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Boggs, TE、Friedman, JS & Gross, JB 洞窟魚の赤血球の変化は、減少した地下酸素への適応の証拠を提供します。 Sci Rep 12、3735 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-07619-0

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受信日: 2021 年 11 月 19 日

受理日: 2022 年 2 月 15 日

公開日: 2022 年 3 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-07619-0

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